糖蜜生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白的研究

    研究混菌種發(fā)酵提取蛋白飼料的最佳工藝條件，采用單因素及正交方法，以微生物含量為主要指標(biāo)，考察菌種組合、菌種配比、投菌量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵濃度、發(fā)酵pH、氮源和無機(jī)鹽等因素對發(fā)酵蛋白質(zhì)產(chǎn)量的影響。試驗結(jié)果表明，發(fā)酵生產(chǎn)蛋白的最佳發(fā)酵工藝為滅菌工藝，最佳菌種組合為白地霉、熱帶假絲酵母和產(chǎn)朊假絲酵母，投菌量為10 %，糖蜜最佳發(fā)酵濃度為20g/100mL，溫度30℃，初始pH 5.0，投加適量酵母膏、硫酸鎂、磷酸二氫鉀和過磷酸鈣。試驗為糖蜜廢液資源化利用提供了理論和試驗依據(jù)

    【關(guān)鍵詞 混合菌種 發(fā)酵條件 飼料蛋白質(zhì)】
　　材料與方法
　　1 試驗菌株
　　白地霉( Geotrichum candidum link) GIM2. 69; 熱帶假絲酵母( Candidia tropicals ) AS2. 637 ; 皮狀絲孢酵母( Trichosporon cutaneum) AS2. 570; 產(chǎn)朊假絲酵母( Candida utilis looderet Kreger ) van Rij) AS2. 81( 由廣東微生物研究所微生物菌種保藏中心提供。
　　2 實驗原料
　　甘蔗糖蜜來自于廣西。
　　3 實驗設(shè)備
　　振蕩培養(yǎng)箱( SPX- 150B-2 型, 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠) , 生化培養(yǎng)箱( LRH-250A 型, 廣東省醫(yī)療器械廠),手提式高壓滅菌器( YXQ. SG41-280A型) , 離心機(jī)( 800 型, 常州國華電器有限公司)，磁力攪拌器(HJ- 3 型, 常州國華電器有限公司) , 精密pH 計( pHS- 3C, 上海精密科學(xué)儀器有限公司) , 手持糖量計(WYTO- 80% 型, 成都泰華光學(xué)有限公司) 和生物潔凈工作臺( BCM-1000 型, 蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)
　　4 培養(yǎng)基的制備
    1) 斜面培養(yǎng)基 麥芽汁( 稀釋至10%BX)，萄糖2% , 酵母膏0.5, 瓊脂2% , 自然pH,115℃
    2) 一級種子培養(yǎng)基成分同種子培養(yǎng)基, 不加瓊脂, 115℃滅菌30 min。
    3) 馴化種子培養(yǎng)基糖蜜廢液50% , pH5.0,115℃菌30min。
    4) 發(fā)酵培養(yǎng)基 糖蜜廢液50% , 加少量氮源和磷源, 自然pH。
　　5 培養(yǎng)方法
　　接種量10%, 30℃在恒溫振蕩培養(yǎng)箱中140r/min, 發(fā)酵72h。
    1）過程斜面種子活化12-24h→一級種子培養(yǎng)24-36h→馴化種子培養(yǎng)48-72 h→ 搖瓶發(fā)酵培
    2）搖瓶培養(yǎng)條件在恒溫振蕩培養(yǎng)箱中接入混合菌種, 30℃,140r/ min進(jìn)行酵母培養(yǎng)72 h。
    6 菌體生物量( 以細(xì)胞干質(zhì)量表示) 測定方法
　　量取細(xì)胞培養(yǎng)液50 mL, 離心分離15 min, 轉(zhuǎn)速為4000 r/min。離心后經(jīng)預(yù)處理( 見圖1) , 去除培養(yǎng)基成分, 將濕菌體置于干燥箱中, 在105 e 下烘干至恒質(zhì)量, 然后稱質(zhì)量。

　　
    結(jié)果與分析
　　1 發(fā)酵工藝的確定
　　發(fā)酵的廢糖蜜原料分為2 種, 即滅菌和不滅菌原料。在液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中分別接入白地霉、熱帶假絲酵母、皮狀絲孢酵母和產(chǎn)朊假絲酵母, 發(fā)酵后分析其微生物含量。
　　不滅菌液態(tài)發(fā)酵工藝 廢糖蜜及其他輔料混均→ 接種→發(fā)酵→分析測試。
　　滅菌液體發(fā)酵工藝 廢糖蜜及其他輔料→ 混均→ 滅菌( 加熱到80- 90℃維持1h)→ 接種→發(fā)酵→ 分析測試。
　　廢糖蜜培養(yǎng)基在滅菌后經(jīng)混合菌發(fā)酵產(chǎn)生的菌體蛋白明顯高于未經(jīng)滅菌的廢液培養(yǎng)基。這可能是因為滅菌后廢液培養(yǎng)基中, 與酵母菌有競爭關(guān)系的其他微生物被殺滅, 給存菌種的生長提供了更好的發(fā)酵環(huán)境, 也可能是因為糖蜜廢液在高溫環(huán)境下, 其中部分難被酵母菌利用的物質(zhì)分解為易被酵母菌利用的物質(zhì), 至使產(chǎn)量均明顯增高( 見圖2)

　　2 最佳混合菌種的確定
　　在廢液培養(yǎng)基中, 按不同組合接入白地霉、熱帶假絲酵母、皮狀絲孢酵母和產(chǎn)朊假絲酵母, 菌種添加量為10 %, 各菌種間比例為1：1：1, 研究對混合菌種發(fā)酵產(chǎn)物中蛋白質(zhì)的影響( 見圖3) 。

　　在不同組合菌種中, 熱帶假絲酵母、白地霉和產(chǎn)朊假絲酵母混合發(fā)酵得到的產(chǎn)物微生物含量最高,這可能是由于霉菌同化淀粉和纖維素的能力強(qiáng), 可將廢液中的淀粉和纖維素降解為酵母能利用的單糖和雙糖等簡單糖類物質(zhì), 使酵母得以良好地生長繁殖, 實現(xiàn)生物轉(zhuǎn)化蛋白飼料的效果。采用2 種或超過2 種微生物發(fā)酵, 體現(xiàn)了微生物間的互惠和偏利生等關(guān)系。該發(fā)酵形式對各種原料的有效轉(zhuǎn)化和蛋白飼料品質(zhì)的提高起到重要作用。

　　3 混合菌種最佳比例的確定
　　為確定白地霉、熱帶假絲酵母和產(chǎn)朊假絲酵母間的合適配比, 3 種菌按不同配比接種廢液培養(yǎng)基
中發(fā)酵。由圖4 可看出, 當(dāng)白地霉、熱帶假絲酵母和產(chǎn)朊假絲酵母間的比例為1：1：1 時, 發(fā)酵后微生物含量最高。從發(fā)酵結(jié)果看, 若接入白地霉過多, 則發(fā)酵料有較濃的霉味, 使飼料的香味和色澤受到一定影響。若接入白地霉過少, 則分泌的纖維素分解酶和淀粉酶等酶不足, 不利于廢糖蜜的分解, 分解出的葡萄糖和其他可發(fā)酵性糖過少, 導(dǎo)致熱帶假絲酵母和產(chǎn)朊假絲酵母的繁殖效率降低。恰當(dāng)?shù)慕臃N比例使各微生物在發(fā)酵過程中具有良好的協(xié)同作用。

　　4 投菌量的確定
　　投菌量對實驗結(jié)果有一定的影響, 故在100mL廢液培養(yǎng)基中分別接入5%、15%、15%和20% 混合菌種, 各菌種添加比例為1：1：1, 發(fā)酵后的酵母菌產(chǎn)量見圖5。隨著接種量的增加, 酵母菌體的產(chǎn)量也隨之增加, 用15 %和20% 接種量發(fā)酵后, 二者蛋白質(zhì)含量變化不大。從經(jīng)濟(jì)角度和生產(chǎn)實踐需要來看, 接入量為15% 能滿足需求。

　　5 糖蜜廢液最佳稀釋濃度的確定
　　廢糖蜜中含有約50%的可發(fā)酵性糖, 濃度過高會抑制酵母菌的生長和發(fā)酵; 濃度過低, 可發(fā)酵性糖的酵母轉(zhuǎn)換率過低。因此, 應(yīng)選擇不同的糖蜜濃度進(jìn)行發(fā)酵實驗。由圖6 可知, 隨著糖蜜濃度的增加, 干酵母的產(chǎn)量逐漸增加。20 g/100 mL 時干酵母的收獲量最大,25g/100 mL時培養(yǎng)基中的可發(fā)酵性糖濃度過高, 抑制混合菌的生長。因此, 最適發(fā)酵糖蜜濃度為
20g/100 mL。

　　6 發(fā)酵廢液最佳pH 的確定
　　廢糖蜜稀釋后, 加酸澄清除雜, 稀糖蜜的pH 對酵母的生長沒有影響。其生長最適pH 可通過實驗確定。用HCl 調(diào)節(jié)發(fā)酵廢液pH 后接種混合菌種。由圖7 可看出, 混合菌種生長的最適pH 可通過實驗。用HCI調(diào)節(jié)發(fā)酵廢液pH 后接種混合菌種。
　　由圖7 可看出, 混合菌種生長的最適pH 為5.0,此時廢液發(fā)酵獲得的干酵母最多。

　　7 菌種最佳發(fā)酵溫度的確定
　　發(fā)酵溫度對微生物的生長有很大的影響,溫度過高或過低均不利于微生物生長。用不同的溫度進(jìn)行發(fā)酵實驗,以確定最適培養(yǎng)溫度,實驗結(jié)果見圖8。隨著溫度的上升,干酵母的獲得量逐漸增加。當(dāng)溫度超過30℃時, 干酵母獲得量開始下降, 因此，菌種的最適發(fā)酵溫度為30℃。
　　8 無機(jī)鹽的選擇
　　無機(jī)鹽是微生物發(fā)酵過程中的生長刺激因子,是微生物生長必不可少的營養(yǎng)物質(zhì), 它為機(jī)體生長提供必要的金屬元素, 維持細(xì)胞的穩(wěn)定性, 能調(diào)節(jié)和保持細(xì)胞的添壓平衡, 可控制細(xì)胞的氧化還原電位,從而提高生物活性。適量的有效無機(jī)鹽可促進(jìn)微生物的快速繁殖。故在廢液培養(yǎng)基中加入不同無機(jī)鹽以研究其發(fā)酵結(jié)果。

　　由圖9 可知, 硫酸鎂、磷酸二氫鉀和過磷酸鈣的最佳添加量分別是0.3、0.3 和0.6g/ 100mL。

　　9 氮源的選擇
　　氮源對微生物的生長繁殖有著重要作用, 是合成菌體中蛋白質(zhì)和核酸的主要原料, 其來源有2 方面: 培養(yǎng)料自身的含氮物質(zhì)和外界加入的含氮物質(zhì)。一般來說, 外界加入的氮源對微生物的生長有更明顯的作用。采用有機(jī)氮源和無機(jī)氮源進(jìn)行實驗, 實驗因素水平見表1, 結(jié)果見表2。由表2 可看出, 影響干酵母產(chǎn)量的因素主次順序是D> A> C> B, 即酵母膏> 尿素> 蛋白胨> 硝酸鈉。由正交實驗結(jié)果可看出, 混合發(fā)酵的最佳氮源是酵母膏。

    結(jié)  論

　　1 利用廢糖蜜發(fā)酵生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白的最佳菌種為白地霉、熱帶假絲酵母和產(chǎn)朊假絲酵母以1：1：1的比例組合, 投菌量為10%, 在20g/100mL 的糖蜜廢液中, 分別加硫酸鎂、磷酸二氫鉀和過磷酸鈣至0.3、0.3 和0.6 /100 mL,調(diào)節(jié)pH 為5.0, 在30℃下發(fā)酵72 h, 經(jīng)干燥處理, 可獲得酵母干菌體。
　　2 廢糖蜜是制糖工業(yè)的主要廢棄物, 經(jīng)稀釋、酸化、澄清和加營養(yǎng)鹽后, 在最適發(fā)酵條件下生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白, 具有很好的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益, 并具有很好的發(fā)展前景。（本文搜集整理于網(wǎng)絡(luò)，如有侵權(quán)之處，請聯(lián)系我們刪除。）