研究混菌種發(fā)酵提取蛋白飼料的最佳工藝條件,采用單因素及正交方法,以微生物含量為主要指標(biāo),考察菌種組合、菌種配比、投菌量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵濃度、發(fā)酵pH、氮源和無機(jī)鹽等因素對(duì)發(fā)酵蛋白質(zhì)產(chǎn)量的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明,發(fā)酵生產(chǎn)蛋白的最佳發(fā)酵工藝為滅菌工藝,最佳菌種組合為白地霉、熱帶假絲酵母和產(chǎn)朊假絲酵母,投菌量為10 %,糖蜜最佳發(fā)酵濃度為20g/100mL,溫度30℃,初始pH 5.0,投加適量酵母膏、硫酸鎂、磷酸二氫鉀和過磷酸鈣。試驗(yàn)為糖蜜廢液資源化利用提供了理論和試驗(yàn)依據(jù)
【關(guān)鍵詞 混合菌種 發(fā)酵條件 飼料蛋白質(zhì)】
材料與方法
1 試驗(yàn)菌株
白地霉( Geotrichum candidum link) GIM2. 69; 熱帶假絲酵母( Candidia tropicals ) AS2. 637 ; 皮狀絲孢酵母( Trichosporon cutaneum) AS2. 570; 產(chǎn)朊假絲酵母( Candida utilis looderet Kreger ) van Rij) AS2. 81( 由廣東微生物研究所微生物菌種保藏中心提供。
2 實(shí)驗(yàn)原料
甘蔗糖蜜來自于廣西。
3 實(shí)驗(yàn)設(shè)備
振蕩培養(yǎng)箱( SPX- 150B-2 型, 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠) , 生化培養(yǎng)箱( LRH-250A 型, 廣東省醫(yī)療器械廠),手提式高壓滅菌器( YXQ. SG41-280A型) , 離心機(jī)( 800 型, 常州國華電器有限公司),磁力攪拌器(HJ- 3 型, 常州國華電器有限公司) , 精密pH 計(jì)( pHS- 3C, 上海精密科學(xué)儀器有限公司) , 手持糖量計(jì)(WYTO- 80% 型, 成都泰華光學(xué)有限公司) 和生物潔凈工作臺(tái)( BCM-1000 型, 蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)
4 培養(yǎng)基的制備
1) 斜面培養(yǎng)基 麥芽汁( 稀釋至10%BX),萄糖2% , 酵母膏0.5, 瓊脂2% , 自然pH,115℃
2) 一級(jí)種子培養(yǎng)基成分同種子培養(yǎng)基, 不加瓊脂, 115℃滅菌30 min。
3) 馴化種子培養(yǎng)基糖蜜廢液50% , pH5.0,115℃菌30min。
4) 發(fā)酵培養(yǎng)基 糖蜜廢液50% , 加少量氮源和磷源, 自然pH。
5 培養(yǎng)方法
接種量10%, 30℃在恒溫振蕩培養(yǎng)箱中140r/min, 發(fā)酵72h。
1)過程斜面種子活化12-24h→一級(jí)種子培養(yǎng)24-36h→馴化種子培養(yǎng)48-72 h→ 搖瓶發(fā)酵培
2)搖瓶培養(yǎng)條件在恒溫振蕩培養(yǎng)箱中接入混合菌種, 30℃,140r/ min進(jìn)行酵母培養(yǎng)72 h。
6 菌體生物量( 以細(xì)胞干質(zhì)量表示) 測(cè)定方法
量取細(xì)胞培養(yǎng)液50 mL, 離心分離15 min, 轉(zhuǎn)速為4000 r/min。離心后經(jīng)預(yù)處理( 見圖1) , 去除培養(yǎng)基成分, 將濕菌體置于干燥箱中, 在105 e 下烘干至恒質(zhì)量, 然后稱質(zhì)量。
結(jié)果與分析
1 發(fā)酵工藝的確定
發(fā)酵的廢糖蜜原料分為2 種, 即滅菌和不滅菌原料。在液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中分別接入白地霉、熱帶假絲酵母、皮狀絲孢酵母和產(chǎn)朊假絲酵母, 發(fā)酵后分析其微生物含量。
不滅菌液態(tài)發(fā)酵工藝 廢糖蜜及其他輔料混均→ 接種→發(fā)酵→分析測(cè)試。
滅菌液體發(fā)酵工藝 廢糖蜜及其他輔料→ 混均→ 滅菌( 加熱到80- 90℃維持1h)→ 接種→發(fā)酵→ 分析測(cè)試。
廢糖蜜培養(yǎng)基在滅菌后經(jīng)混合菌發(fā)酵產(chǎn)生的菌體蛋白明顯高于未經(jīng)滅菌的廢液培養(yǎng)基。這可能是因?yàn)闇缇髲U液培養(yǎng)基中, 與酵母菌有競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系的其他微生物被殺滅, 給存菌種的生長提供了更好的發(fā)酵環(huán)境, 也可能是因?yàn)樘敲蹚U液在高溫環(huán)境下, 其中部分難被酵母菌利用的物質(zhì)分解為易被酵母菌利用的物質(zhì), 至使產(chǎn)量均明顯增高( 見圖2)
2 最佳混合菌種的確定
在廢液培養(yǎng)基中, 按不同組合接入白地霉、熱帶假絲酵母、皮狀絲孢酵母和產(chǎn)朊假絲酵母, 菌種添加量為10 %, 各菌種間比例為1:1:1, 研究對(duì)混合菌種發(fā)酵產(chǎn)物中蛋白質(zhì)的影響( 見圖3) 。
在不同組合菌種中, 熱帶假絲酵母、白地霉和產(chǎn)朊假絲酵母混合發(fā)酵得到的產(chǎn)物微生物含量最高,這可能是由于霉菌同化淀粉和纖維素的能力強(qiáng), 可將廢液中的淀粉和纖維素降解為酵母能利用的單糖和雙糖等簡(jiǎn)單糖類物質(zhì), 使酵母得以良好地生長繁殖, 實(shí)現(xiàn)生物轉(zhuǎn)化蛋白飼料的效果。采用2 種或超過2 種微生物發(fā)酵, 體現(xiàn)了微生物間的互惠和偏利生等關(guān)系。該發(fā)酵形式對(duì)各種原料的有效轉(zhuǎn)化和蛋白飼料品質(zhì)的提高起到重要作用。
3 混合菌種最佳比例的確定
為確定白地霉、熱帶假絲酵母和產(chǎn)朊假絲酵母間的合適配比, 3 種菌按不同配比接種廢液培養(yǎng)基
中發(fā)酵。由圖4 可看出, 當(dāng)白地霉、熱帶假絲酵母和產(chǎn)朊假絲酵母間的比例為1:1:1 時(shí), 發(fā)酵后微生物含量最高。從發(fā)酵結(jié)果看, 若接入白地霉過多, 則發(fā)酵料有較濃的霉味, 使飼料的香味和色澤受到一定影響。若接入白地霉過少, 則分泌的纖維素分解酶和淀粉酶等酶不足, 不利于廢糖蜜的分解, 分解出的葡萄糖和其他可發(fā)酵性糖過少, 導(dǎo)致熱帶假絲酵母和產(chǎn)朊假絲酵母的繁殖效率降低。恰當(dāng)?shù)慕臃N比例使各微生物在發(fā)酵過程中具有良好的協(xié)同作用。
4 投菌量的確定
投菌量對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有一定的影響, 故在100mL廢液培養(yǎng)基中分別接入5%、15%、15%和20% 混合菌種, 各菌種添加比例為1:1:1, 發(fā)酵后的酵母菌產(chǎn)量見圖5。隨著接種量的增加, 酵母菌體的產(chǎn)量也隨之增加, 用15 %和20% 接種量發(fā)酵后, 二者蛋白質(zhì)含量變化不大。從經(jīng)濟(jì)角度和生產(chǎn)實(shí)踐需要來看, 接入量為15% 能滿足需求。
5 糖蜜廢液最佳稀釋濃度的確定
廢糖蜜中含有約50%的可發(fā)酵性糖, 濃度過高會(huì)抑制酵母菌的生長和發(fā)酵; 濃度過低, 可發(fā)酵性糖的酵母轉(zhuǎn)換率過低。因此, 應(yīng)選擇不同的糖蜜濃度進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。由圖6 可知, 隨著糖蜜濃度的增加, 干酵母的產(chǎn)量逐漸增加。20 g/100 mL 時(shí)干酵母的收獲量最大,25g/100 mL時(shí)培養(yǎng)基中的可發(fā)酵性糖濃度過高, 抑制混合菌的生長。因此, 最適發(fā)酵糖蜜濃度為
20g/100 mL。
6 發(fā)酵廢液最佳pH 的確定
廢糖蜜稀釋后, 加酸澄清除雜, 稀糖蜜的pH 對(duì)酵母的生長沒有影響。其生長最適pH 可通過實(shí)驗(yàn)確定。用HCl 調(diào)節(jié)發(fā)酵廢液pH 后接種混合菌種。由圖7 可看出, 混合菌種生長的最適pH 可通過實(shí)驗(yàn)。用HCI調(diào)節(jié)發(fā)酵廢液pH 后接種混合菌種。
由圖7 可看出, 混合菌種生長的最適pH 為5.0,此時(shí)廢液發(fā)酵獲得的干酵母最多。
7 菌種最佳發(fā)酵溫度的確定
發(fā)酵溫度對(duì)微生物的生長有很大的影響,溫度過高或過低均不利于微生物生長。用不同的溫度進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn),以確定最適培養(yǎng)溫度,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖8。隨著溫度的上升,干酵母的獲得量逐漸增加。當(dāng)溫度超過30℃時(shí), 干酵母獲得量開始下降, 因此,菌種的最適發(fā)酵溫度為30℃。
8 無機(jī)鹽的選擇
無機(jī)鹽是微生物發(fā)酵過程中的生長刺激因子,是微生物生長必不可少的營養(yǎng)物質(zhì), 它為機(jī)體生長提供必要的金屬元素, 維持細(xì)胞的穩(wěn)定性, 能調(diào)節(jié)和保持細(xì)胞的添壓平衡, 可控制細(xì)胞的氧化還原電位,從而提高生物活性。適量的有效無機(jī)鹽可促進(jìn)微生物的快速繁殖。故在廢液培養(yǎng)基中加入不同無機(jī)鹽以研究其發(fā)酵結(jié)果。
由圖9 可知, 硫酸鎂、磷酸二氫鉀和過磷酸鈣的最佳添加量分別是0.3、0.3 和0.6g/ 100mL。
9 氮源的選擇
氮源對(duì)微生物的生長繁殖有著重要作用, 是合成菌體中蛋白質(zhì)和核酸的主要原料, 其來源有2 方面: 培養(yǎng)料自身的含氮物質(zhì)和外界加入的含氮物質(zhì)。一般來說, 外界加入的氮源對(duì)微生物的生長有更明顯的作用。采用有機(jī)氮源和無機(jī)氮源進(jìn)行實(shí)驗(yàn), 實(shí)驗(yàn)因素水平見表1, 結(jié)果見表2。由表2 可看出, 影響干酵母產(chǎn)量的因素主次順序是D> A> C> B, 即酵母膏> 尿素> 蛋白胨> 硝酸鈉。由正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果可看出, 混合發(fā)酵的最佳氮源是酵母膏。
結(jié) 論
1 利用廢糖蜜發(fā)酵生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白的最佳菌種為白地霉、熱帶假絲酵母和產(chǎn)朊假絲酵母以1:1:1的比例組合, 投菌量為10%, 在20g/100mL 的糖蜜廢液中, 分別加硫酸鎂、磷酸二氫鉀和過磷酸鈣至0.3、0.3 和0.6 /100 mL,調(diào)節(jié)pH 為5.0, 在30℃下發(fā)酵72 h, 經(jīng)干燥處理, 可獲得酵母干菌體。
2 廢糖蜜是制糖工業(yè)的主要廢棄物, 經(jīng)稀釋、酸化、澄清和加營養(yǎng)鹽后, 在最適發(fā)酵條件下生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白, 具有很好的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益, 并具有很好的發(fā)展前景。(本文搜集整理于網(wǎng)絡(luò),如有侵權(quán)之處,請(qǐng)聯(lián)系我們刪除。)